Um in kurzer Zeit eine hohe Anzahl genetisch identischer pathogen-freier Himbeer-Pflanzen produzieren zu können, werden selektierte Klone gewünschter Sorten unter sterilen und kontrollierten Bedingungen im Labor mikrovermehrt.
Vorbereitung des Pflanzenmaterials für die Etablierung
Der erste vorbereitende Schritt für die Himbeer-Etablierung im Labor ist die Kultivierung und Selektion von Mutterpflanzen im Gewächshaus. Definierte virusgetestete Pflanzen werden in Standardsubstrat kultiviert. Die Meristeme von Winter- und Frühjahrsruten können für die In-vitro-Etablierung von Himbeeren verwendet werden. Verholzte Winterruten werden abgeschnitten und bei Zimmertemperatur in einem Wasserglas auf der Fensterbank angetrieben. Die Ruten treiben nach ein bis zwei Wochen aus. Sobald der Austrieb zwei bis drei Zentimeter lang ist, kann dieser vom alten Holz abgeschnitten und sterilisiert werden. Andererseits kann im zweiten Quartal des Jahres das frische juvenile Pflanzenmaterial für die Etablierung genutzt werden. Diese Frischaustriebe werden direkt in einzelne Nodien geschnitten und sterilisiert.
Entfernung von anhaftenden Pilzen und Bakterien durch Sterilisation
Optimale Konzentration der Sterilisationslösung sowie Inkubationszeit ist stets ein Kompromiss zwischen einerseits der Möglichkeit Mikroorganismen abzutöten und andererseits die Vitalität des Pflanzenmeristems nicht zu beeinträchtigen. Je nach Zustand des Pflanzenmaterials wird Konzentration und Inkubationszeit der Sterilisationslösung spezifisch angepasst.
Als Desinfektionslösung wird in der Regel Natriumhypochlorit oder Ethanol verwendet. Das Pflanzenmaterial inkubiert ca. 20 bis 30 Minuten in der Desinfektionslösung und wird geschüttelt. Mit Hilfe dieser Oberflächensterilisation werden eventuell anhaftende Mikroorganismen abgetötet, um in der weiteren Kultur keine Kontaminationen mit Bakterien und Pilzen zu haben. Dennoch können während der fortschreitenden Kultivierung Endophyten aus Explantaten austreten und auf der Nährlösung sichtbar werden. In einer sterilen Werkbank wird die Sterilisierungslösung entfernt und das Pflanzenmaterial mit autoklaviertem destilliertem Wasser gewaschen, um Chlor- bzw. Ethanol-Rückstände zu entfernen. Diese könnten den Austrieb der Explantate hemmen und sich negativ auf die weitere Entwicklung der Pflänzchen auswirken.
Verwendung von ganzen Nodien oder präparierten Achselknospen?
Auf Nährlösung können im ersten Schritt Nodien oder Achselknospen gesetzt werden. Bei juvenilen Ruten wird sortenspezifisch entschieden, ob die Etablierung mittels ganzer Nodien oder herausparierter Achselknospen erfolgt – je nachdem, welche Methode in der Vergangenheit für den Austrieb der jeweiligen Sorte besser geeignet war. Das direkte Einsetzen von Nodien ohne Präparation ist bei Winterruten nicht möglich, weil das alte Holz anfällig für Verunreinigungen ist. Eine vollständige Sterilisation ohne Schädigung des Meristems, aufgrund einer hoch konzentrierten Desinfektionslösung, ist nicht zu realisieren. Daher sollten bei Winterruten die Achselknospen mit Hilfe der Vergrößerung durch ein Binokularmikroskop herauspräpariert und die äußeren Gewebeschichten dieser Knospen abgeschält werden. Diese Schälung wird auch bei juvenilem Material je nach Größe der Knospen vorgenommen. Bei sehr kleinen äußerst jungen Achselknospen ist diese Schälung nicht notwendig. Mehrere Achselknospen können in eine Petrischale mit Nährlösung gegeben werden – unter der Voraussetzung, dass die Kulturgefäße regelmäßig kontrolliert werden, damit sterile Meristeme von unsterilen getrennt werden können.
Nährmedium für Wachstum, Differenzierung und Vermehrung
Die Nährlösung liefert den eingesetzten Meristemen notwendige Nährstoffe, Vitamine und Salze für das weitere Wachstum. Da die In-vitro-Pflanzen keine Photosynthese betreiben, wird als fremde Kohlenstoffquelle Zucker in die Nährlösung gegeben. Für die Verfestigung des Mediums wird Agar als Geliermittel hinzugefügt. Natürliche oder synthetische Pflanzenwachstumsregulatoren werden hinzugegeben, um die Teilung und Differenzierung der Meristemzellen anzuregen. Die Explantate entwickeln sich zu kleinen Pflänzchen, die sich vermehren und mit der Ausgangspflanze genetisch identisch sind. Die frischen Vermehrungen werden mit sterilem Skalpell geteilt und auf neue Nährlösung überführt. Durch kontinuierliche Wiederholung des Schneidens und Umsetzens kann eine gezielte Hochvermehrung des Pflanzenmaterials erfolgen.
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